Real-time PCR

Die real-time PCR ist ein Verfahren zum spezifischen und sensitiven Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz durch eine starke Vermehrung (Amplifizierung) dieser Zielsequenz.

Die PCR Technologie nutzt das Potential eines Enzyms, das prinzipiell in jedem Lebewesen auf der Erde zu finden ist: die DNA-Polymerase. Dieses Protein kann einen DNA Einzelstrang zu einem komplementären Doppelstrang ergänzen und damit die Menge des zu detektierenden Zielmoleküls erhöhen.

Das PCR-Prinzip

PCR, bzw. Polymerase Chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) wird definiert als molekulare Technik, die die Produktion großer Mengen spezifischer DNA ausgehend von einem DNA-Template (Vorlage) durch eine Enzymreaktion ohne die Beteiligung eines lebenden Organismus ermöglicht. Dazu nutzt die PCR das Potential eines Enzyms, das prinzipiell in jeder Zelle zu finden ist: die DNA Polymerase. Dieses Protein vervollständigt einen DNA-Einzelstrang mit dem komplementären Doppelstrang und ist wesentlicher Bestandteil des zelleigenen Apparates zur Reproduktion der DNA.

Ein PCR Ansatz enthält:

• die Template DNA (Proben-DNA)
• eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase)
• ein Paar spezifischer Oligonukleotidprimer - ihre Sequenz ist komplementär zu   den Randbereichen der zu amplifizierenden DNA
• 4 verschiedene Nukleosidtriphosphate (dNTPs), die Bausteine der DNA
• einen Puffer, der als Cofaktor aus Mg²⁺ enthält

Die Kopie eines DNA-Abschnittes erfolgt in drei Schritten:

1. Denaturierung:

Durch die Erhöhung der Temparatur wird der DNA Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufgetrennt.

2. Annealing:

Durch absenken der Temperatur binden die Primer an ihre komplementären Abschnitte auf dem DNA Strang und bilden den Ausgangspunkt für Taq-Polymerase.

3. Extension:

Die Taq-Polymerase ergänzt die Einzelstränge zu Doppelsträngen ausgehend von den Primern. Gegebenenfalls wird hierfür die Temperatur auf das Optimum des Enzyms erhöht, schneller sind allerdings Two-Step PCR Protokolle, bei denen die Extension bei identischer Temperatur wie das Annealing stattfindet.

Durch mehrmalige Wiederholung dieses Cyclus vermehrt sich die Kopienzahl des Sequenzabschnittes exponentiell, so dass in kurzer Zeit eine Große Menge des Zielmoleküls entsteht.

Die real-time PCR

Die real-time PCR (oder auch qPCR) ist eine Weiterentwicklung der klassischen PCR. Sie folgt dem gleichen Prinzip der DNA Vermehrung, hat aber ein anderes System der Detektion: Die Entstehung neuer Kopien der Zielsequenz wird mit einem Fluorenszenzsignal gekoppelt, dass während des PCR Prozesses (real-time, also in Echtzeit) elektronisch detektiert und ausgewertet werden kann. Dazu gibt es verschiedene Techniken. Die SureFood real-time PCR Kits verwenden ausschließlich das im Folgenden kurz erklärte System der Hydrolysation-Probes (Hydrolysesonden):

Diese Sonden sind, vergleichbar den Primern, kurze Oligonukleotidstücke, deren Sequenz komplementär zu einem Abschnitt auf dem, durch die PCR amplifizierten Sequenzstück liegt. Zusätzlich ist an dieses Molekül ein Fluoreszensfarbstoff (Fluorophor) und ein sogenannter Quencher gekoppelt. Der Quencher unterdrückt die fluoreszierenden Eigenschaften des Fluorophors solange er sich in dessen unmittelbarer Nähe befindet. Dies wird durch die Verbindung über das Oligonukleotid gewährleistet.

Die Sonde lagert im Annealingschritt ähnlich wie Primer am DNA Einzelstrang an. Bei der Elongation ist dieses kurze Stück Doppelstrang der DNA-Polymerase im Weg. Zusätzlich zu Ihrer Doppelstrang-synthetisierenden Funktion besitzt diese aber auch in die entgegengesetzte Strangrichtung eine Exonukleasefunktion. Diese ermöglicht die Hydrolyse solch kurzer Doppelstrangstücke. Wird aber die Sonde durch die Polymerase hydrolysiert, entfernen sich Fluorophor und Quencher voneinander und der Fluorophor kann seine Fluoreszenzeigenschaften entfalten und erzeugt ein messbares Signal. Je mehr Kopien der Zielsequenz entstehen, umso mehr Fluoreszenzmolekühle werden freigesetzt. Dem entsprechend wird das Fluoreszenzsignal stärker.